В Ла-Хойя я занимался изучением адреналиновых рецепторов, обнаруживая их в липидных мембранах и клетках вегетативной нервной системы, регулирующей не контролируемые сознанием процессы – от эякуляции до расширения зрачков и сердцебиения. Логическим продолжением работы было выделение и очистка белковых рецепторов для дальнейшего изучения их молекулярных структур, которые являются ключом к расшифровке механизма их действия.
Такие редкие белки, как адреналиновый рецептор, никогда ранее не выделяли, не говоря уже о белках в клеточных мембранах. Вначале нужно было разработать способ измерения концентрации белка, выделенного из мембраны. Мы провели почти год, совершенствуя метод обнаружения следовых количеств белкового рецептора и используя для этого бета-блокатор с радиоактивным йодом. Нам было известно, что этот лекарственный препарат может связываться с рецептором.
Как только нам удалось пометить рецептор радиоактивным йодом, мы с помощью множества различных методов выделили его из липидной мембраны, оценивая результат по остаточному уровню радиоактивности на стеклянных фильтрах. Следующим шагом стала очистка рецептора от огромного разнообразия других клеточных белков, которые также выделили из мембраны. Были испробованы десятки различных подходов, причем по несколько сотен раз.
За время работы над докторской диссертацией я не приобрел никакого опыта решения подобных задач, не умел ставить столь длительные, сложные эксперименты и теперь учился на собственных ошибках. А делал я их, разумеется, немало. Я начал понимать, как руководить проведением опытов, как стимулировать, направлять, поощрять, перенаправлять и обучать студентов, аспирантов, постдоков, техников и как улаживать непростые отношениями между ними. Я научился увольнять и, самое главное, находить и брать на работу лучших специалистов.
Научные исследования в университетах ведут аспиранты и постдоки, поэтому между лабораториями идет жесткая борьба за перспективных кандидатов. Мне повезло – я работал в бурно развивающейся области науки, а это означало, что у меня появилось несколько отличных претендентов. Одна из них – Клэр Фрейзер, тогда только что блестяще закончившая Политехнический институт Ренсселера, ведущий научно-технический вуз в северной части штата Нью-Йорк.
Ее уже приняли на работу в Йельский университет, но она все же пришла на собеседование, так как была обручена с банкиром из Торонто, а Буффало был ближайшим американским городом с пристойным университетом. Клэр произвела на меня хорошее впечатление, но я был уверен, что мы вряд ли снова встретимся. Однако через несколько месяцев я узнал, что она будет работать в моем отделе. Побывав в течение испытательного срока в нескольких институтах, она выбрала именно мою лабораторию, и я был этому очень рад. В 1979 году мы опубликовали статью о методике растворения адреналиновых рецепторов с помощью детергентов – довольно хитроумного приема.
Клэр быстро усвоила новые методы, которые я начал применять для этих исследований. Казалось, мы удачно дополняем друг друга: я – амбициозный ученый, работающий по нескольким направлениям с помощью самых разных методик, дабы добиться международного признания, и Клэр – сдержанная девушка из Новой Англии, дочь директора школы, четкая и организованная, чье пристальное внимание и интерес к деталям прекрасно сочетались с моим несколько хаотичным энтузиазмом.
Мне хотелось предложить ей сложную и неординарную тему диссертации, и одной из идей было использование моноклональных антител, специфичных к рецептору, для выделения его из сложных смесей белков и последующей очистки. В то время весь научный мир только и говорил о механизме получения моноклональных антител, который придумали Жорж Кёлер и Сезар Мильштейн из Кембриджа, – открытии, практически гарантирующем Нобелевскую премию.
Каждое поликлональное антитело в крови человека образуется из простых белых кровяных телец (лейкоцитов), которые размножаются и превращаются в миллионы копий самих себя (клональная экспансия). Кёлер и Мильштейн разработали метод выделения отдельных лейкоцитов и отдельных (моноклональных) антител.
Клэр согласилась заняться изучением рецепторов антител, и мы быстро разработали методику их выделения, способную конкурировать с методом радиоактивных меток. Этот смелый подход очень скоро принес свои плоды. Первый успешный опыт мы провели при изучении астмы, поскольку это заболевание уже давно связали с действием адреналиновых рецепторов. Кроме всего прочего, я был лично заинтересован в этом исследовании, поскольку сам страдаю от аллергической астмы.
Действие некоторых из наиболее распространенных препаратов против астмы, так называемых агонистов бетарецепторов, заключается в стимуляции адреналиновых рецепторов, которые, в свою очередь, вызывают релаксацию дыхательных мышц. Выдвигалось множество теорий для объяснения связи адреналиновых рецепторов с возникновением астмы.
Например, были данные, что у больных астмой заметно меньше рецепторов адреналина в гладких мышцах дыхательных органов. Причем свободных рецепторов меньше просто потому, что больные бронхиальной астмой вырабатывают свои собственные антитела, блокирующие рецепторы. У нас появился способ это проверить. От врачей, лечащих астму, мы получили образцы крови их пациентов и очень удивились, когда оказалось, что у некоторых серьезно больных имелись антитела к адреналиновым рецепторам. Это было важным открытием. Мы с Клэр послали статью о наших результатах в самый авторитетный журнал Science. Получив подтверждение, что статья будет опубликована, мы просто ликовали.
Моя астма и мои гены
Как и многие другие астматики, в задымленных помещениях я хватаюсь за ингалятор. Генетика обусловливает предрасположенность к астме, поэтому исследователи сосредоточились на изучении группы ферментов глутатион-S-трансферазы (GST), которые способствуют выведению из организма таких соединений, как канцерогены, наркотики и токсины. Считается, что чем лучше организм использует эти антиоксиданты, тем лучше он защищается от переносимых по воздуху загрязнителей, нейтрализуя воздействие вредных частиц и ослабляя аллергическую реакцию.
Два из этих ферментов называются глутатион-S-трансфераза M1 (GSTM) и глутатион S-трансфераза Р1 (GSTP1). Ген фермента GSTM1, обнаруженный на хромосоме 1, встречается в популяции в двух формах – активной и неактивной. У рожденных с двумя неактивными формами гена вообще нет защитных ферментов GSTM1. В эту категорию попадают около 50 % населения. Довольно распространен также вариант гена фермента GSTP1 на хромосоме 11 (ген ile105), и у рожденных с двумя копиями этого гена имеются менее эффективные формы GSTP1.
В исследовании Франка Джиллилэндома из Калифорнийского университета разнообразие вариантов в этом семействе антиоксидантных генов связывалось с реакцией испытуемых на частицы в выхлопных газах дизельных двигателей. Эти частицы вызывали у испытуемых без той формы гена GSTM, которая необходима для вырабатывания антиоксидантов, гораздо более сильную аллергическую реакцию. Испытуемые без гена GSTM1, но с вариантом ile105 – среди американцев таких 15–20 % – испытывали еще более острые аллергические реакции. Анализ моего генома показал, что я принадлежу именно к этой группе, так как одна копия моего гена GSTM1 отсутствует, но есть ген ile105. Дефицит GSTM1 делает меня восприимчивее к определенным химическим канцерогенам, а кроме того, предрасположенным к раку легких и колоректальному раку. Однако есть и отрадная новость – вероятность заболевания астмой связана также с отсутствием другого гена из этого семейства, а именно гена фермента тета-1глутатион-S-трансферазы (GSTT1) на хромосоме 22, но в моем геноме присутствуют обе копии этого гена.
В процессе размышлений о препаратах от астмы у меня возникла любопытная идея. Чаще всего для лечения астмы используют стероиды (глюкокортикоиды), которые снимают воспаление и способствуют синтезу белка в клетках. Возможно ли, что стимулируя синтез рецепторов адреналина, они повышают восприимчивость клеток к нему? Мы придумали простую схему: будем измерять количество рецепторов на поверхности клетки с помощью радиоактивной метки, затем добавим стероидные гормоны и посмотрим, вырастет ли со временем уровень радиоактивности, то есть количество рецепторов. Мы были чрезвычайно довольны, когда обнаружили, что за 12 часов количество рецепторов увеличилась более чем в два раза. Наша статья о механизме действия глюкокортикоидов при заболевании астмой стала одной из наиболее цитируемых.
